双光子显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一项新技术。双光子激发的基本原理：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，这两个光子的能量可以加起来，使得荧光分子的电子跃迁至激发态，其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相当的。为了达到很高的光子密度而又不损伤到细胞，双光子显微镜使用高能量超快脉冲激光器（例如钛宝石飞秒激光器）。
双光子显微镜具有很多优点：1）对样品的光漂白区域小；2）光毒性小；3）穿透力强，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍；4）成像的亮度和信噪比高。因此，双光子显微镜比单光子显微镜更适合长时间的观察和研究活体细胞和组织；更适合对厚的生物样品进行深层次的研究。
